Н

Актуальность исследования. Левотироксин натрия – лекарственное средство, левовращающий изомер тироксина, после частичного метаболизма в печени и почках оказывает влияние на развитие и рост тканей, обмен веществ. Механизмы метаболических эффектов включают рецепторное связывание с геномом, изменения окислительного обмена в митохондриях, а также регулирование потока субстратов и катионов вне и внутри клетки. В малых дозах обладает анаболическим действием. В средних дозах стимулирует рост и развитие, повышает потребность тканей в кислороде, стимулирует метаболизм белков, жиров и углеводов, повышает функциональную активность сердечнососудистой и центральной нервной систем. В больших дозах угнетает выработку тиротропин-рилизинг гормона гипоталамуса и тиреотропного гормона гипофиза [1].

Левотироксин натрия назначается при гипотиреоидных состояниях различной этиологи в том числе обусловленных хирургическим или медикаментозным воздействием, супрессивной тиреоидной терапии простого (нетоксического) зоба, аутоиммунном тиреоидите Хашимото, многоузловом зобе, тиреостатическом лечении гипертиреоза (комплексная терапия после достижения эутиреоидного состояния, тиреотропинзависимых высокодифференцированных папиллярных или фолликулярных карциномах щитовидной железы (комплексное лечение), профилактике рецидива зоба после резекции, а также при проведении супрессионного сцинтиграфического теста щитовидной железы [2].

Лекарственный препарат после всасывания в тонком кишечнике, попадает в кровеносное русло, где связывается практически весь с белками плазмы [3].

Гормон тироксин и его производные, в том числе и левотироксин натрия транспортируются транстиретином (преальбумином), тироксинсвязывающим глобулином и альбумином в печень, головной мозг и мышцы, где главным образом и происходит их метаболизм. Высокие концентрации определенных веществ, содержащихся в крови, могут влиять на транспортную функцию сывороточного альбумина, при этом может происходить снижение связывания левотироксина натрия с альбумином. Несвязанный с белками крови левотироксин натрия практически сразу выводится из кровотока почками, не проявляя своей физиологической функции [4].

Известно, что высокие концентрации этилового спирта вызывают изменение конформации белков вплоть до денатурации, что неблагоприятно сказывается на проявлении их физиологических функций [5].

Цель работы: изучение влияния этилового спирта на связывающую способность левотироксина натрия с сывороточным альбумином.

Материалы и методы исследования. Для проведения эксперимента был приготовлен раствор бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich) 0,66 г/л (10-5 М) в фосфатном буфере pH= 7,48. Регистрацию спектра интенсивности собственной и зондовой флюоресценции проводили на спектрофлюориметре Cary Eclipse (США).

Условия регистрации зондовой и собственной флюоресценции: длина возбуждения 296 нм, длина регистрации 306-600 нм, спектральные ширины щелей возбуждения и флуоресценции по 5 нм; собственной флюоресценции: длина возбуждения 296 нм, длина регистрации 306-650 нм, спектральные ширины щелей излучения и поглощения – 5 нм.

В первой серии экспериментов было изучено влияние левотироксина натрия на параметры собственной флуоресценции бычьего сывороточного альбумина (БСА). Для этого измерили спектры флуоресценции чистого белка и при добавлении 2, 4, 6, 8 и 10 мкг левотироксина натрия. В следующем эксперименте к раствору белка, содержащего 10 мкг левотироксина, добавляли этиловый спирт концентрации: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,2 М и измеряли, как при этом менялась величина интенсивности собственной флуоресценции.

Так же провели отдельный эксперимент по влиянию концентраций 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5;0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 1,1; 1,2 М этилового спирта на интенсивность собственной флуоресценции.

В заключение провели аналогичные опыты, только с добавлением в реакционную среду флуоресцентного зонда 1-анилино-8-нафталинсульфонат (АНС) в концентрации 6*10-5М (Sigma-Aldrich), для изучения показателей зондовой флуоресценции.

Результаты и их обсуждение. В результате проведенных экспериментов по изучению влияния левотироксина натрия, этилового спирта и их совместного действия на собственную флуоресценцию БСА были построены графики, отображенные на рисунке 1.

При действии этилового спирта на БСА, происходят незначительные конформационные переходы, только при концентрации 0,9 М этилового спирта наблюдается значительный конформационный переход, на что указывает значительное снижение интенсивности собственной флуоресценции.

При добавлении левотироксина показатель интенсивности собственной флуоресценции снижался без значительных скачков, что может указывать на незначительные конформационные переходы, происходящие в белке, при связывании его с левотироксином. При добавлении 0,2 М этилового спирта к смеси левотироксина натрия и БСА, интенсивность собственной флуоресценции немного возросла, что может говорить о снижении влияния левотироксина под действием спирта на белок. Однако, при дальнейшем росте концентрации спирта в смеси показатель интенсивности собственной флуоресценции продолжил падение, что может быть результатом денатурирующего влияния самого спирта на белок.

При добавлении левотироксина натрия к БСА, интенсивность его зондовой флуоресценции снижалась, что происходит в результате вытеснения АНС из мест его посадки. АНС и левотироксин конкурируют между собой за одни места связывания в белке. Дальше к смеси белка, зонда и левотироксина добавляли этиловый спирт, при добавлении его 0,2 М интенсивность зондовой флуоресценции снижалась, однако большие концентрации спирта вызывали рост показателя интенсивности зондовой флуоресценции. Частично это может происходить из-за увеличения показателя связывающей способности АНС с альбумином под влиянием спирта, однако, при действии одного спирта без левотироксина интенсивность зондовой флуоресценции меняется не так значительно. Это может происходить только в результате вытеснения левотироксина с мест его посадки на белке под действием спирта, и посадкой на освободившиеся места флуоресцентного зонда, за счет чего происходит более значительный рост интенсивности зондовой флуоресценции.

Выводы. Таким образом, в результате проведенных экспериментов нами было доказано, что этиловый спирт в высоких концентрациях влияет на связывающую способность бычьего сывороточного альбумина к различным лигандам. Так как спирт способствует незначительному росту связывающей способности альбумина к флуоресцентному зонду АНС, вероятно, эта закономерность относится и к другим схожим по химическому строению лигандам. Однако при больших концентрациях спирта связывающая способность альбумина по отношению к левотироксину натрия снижается. Хотя столь высокие концентрации спирта в крови практически не наблюдаются, не исключено, что они могут возникать в организме локально. Можно предположить, что даже низкие концентрации этилового спирта в крови могут пагубно сказываться на транспортной функции альбумина по отношению к другим лигандам.